01  Cultivo celular

El cultivo celular es la operación más básica para los experimentos celulares. A través del cultivo celular, podemos obtener una gran cantidad de células, que pueden utilizarse para futuras investigaciones sobre la función celular y las vías de señalización, por lo que la calidad del cultivo celular afectará directamente a los experimentos celulares posteriores y a la exactitud de los resultados.

Las células son muy frágiles y necesitan ser cuidadas como niños en el proceso del cultivo celular, y su estado necesita ser observado todos los días para ajustar el sistema de cultivo o para ser manejadas adecuadamente. Como las características de crecimiento de cada tipo de célula son diferentes, es importante no operar de forma mecánica y dogmática.

Como el medio de cultivo celular contiene una gran cantidad de nutrientes, los microorganismos ubicuos pueden reproducirse en él; una vez que el medio de cultivo celular está contaminado, se propagará rápidamente, afectando así la calidad del crecimiento celular, por lo que todo el proceso de cultivo celular debe seguir el principio de operación aséptica.

Reactivos comúnmente usados y sus funciones

▲Medio basal (imagen con derechos de autor, por favor no reproducir)

Medio básico: compuesto principalmente por aminoácidos, vitaminas, carbohidratos, iones inorgánicos, etc. Proporciona los nutrientes básicos y el ambiente de cultivo (pH, concentración de CO2) necesarios para el crecimiento celular. Los medios de cultivo básicos comunes incluyen: MEM, DMEM, RPMI-1640, F-12, etc. Diferentes medios de cultivo son adecuados para diferentes líneas celulares.

▲Suero fetal bovino (imagen con derechos de autor, por favor no reproducir)

Suero fetal bovino: Es un aditivo ampliamente utilizado en el cultivo celular, que se obtiene de fetos de ternera nacidos por cesárea, y contiene varios factores de crecimiento, péptidos, hormonas, proteínas de unión, etc. Proporciona varios nutrientes necesarios para el crecimiento celular, y en general se utiliza una concentración del 10% de suero fetal bovino en el medio de cultivo celular, y la concentración requerida por diferentes células es diferente.

▲Resistencia Dual (imagen con derechos de autor, por favor no reproducir)

Antibiótico doble: Es el antibiótico más comúnmente usado en el cultivo celular, los componentes son penicilina y estreptomicina, la penicilina tiene el efecto de matar bacterias Gram-positivas, la estreptomicina funciona principalmente con bacterias Gram-negativas, a menudo se agrega al medio de cultivo celular en una concentración del 1% para prevenir la contaminación celular durante el cultivo celular.

▲PBS (imagen con derechos de autor, por favor no reproducir)

PBS: es decir, solución tampón fosfato, es la solución salina tampón más comúnmente utilizada en el cultivo celular, compuesta de fosfato de hidrógeno disódico, cloruro de sodio, dihidrógeno de potasio alternativamente, cloruro de potasio, isotónica con la sangre humana, comúnmente utilizada en el lavado celular y la configuración de reactivos.

▲Tripsina (imagen con derechos de autor, por favor no reproducir)

Tripsina: una proteína secretada por el páncreas, comúnmente utilizada en la digestión de células adherentes y la dispersión de células de tejido, a menudo añadiendo EDTA para aumentar el efecto digestivo, su actividad digestiva puede ser inhibida por el suero.

Instrumentos comúnmente utilizados y sus funciones

▲Incubadora de cultivo celular (imagen con derechos de autor, por favor no reproducir)

Incubadora de cultivo celular: Es el equipo más central en el proceso de cultivo celular, proporcionando un ambiente confortable para el crecimiento celular. Las condiciones de cultivo para la mayoría de las células son 37℃, concentración de CO2 del 5% y cierta humedad.

▲Banco limpio/gabinete de bioseguridad (imagen con derechos de autor, por favor no reproducir)

Banco ultra limpio/gabinete de bioseguridad: Es el equipo principal para la operación experimental celular, que puede proporcionar un ambiente de operación libre de polvo, estéril y de alta limpieza. El banco ultra limpio puede proteger las muestras celulares, y el gabinete de bioseguridad puede proteger tanto las muestras celulares como a los operadores.

▲Microscopio invertido (imagen con derechos de autor, por favor no reproducir)

Microscopio invertido: se utiliza para observar el estado de crecimiento de las células en el recipiente de cultivo, los microscopios con módulos de fluorescencia también se pueden utilizar para la observación de la fluorescencia celular en los experimentos.

▲Centrífuga (imagen con derechos de autor, por favor no reproducir)

Centrífuga: Se utiliza para separar las células del líquido, sedimentarlas en el fondo del tubo de centrífuga y recolectar las células para cultivos o experimentos posteriores, generalmente se utiliza una centrifugación de 100-200g durante 3-5 minutos para separar las células.

Recipientes de cultivo comúnmente usados:

▲Caja de Petri (imagen con derechos de autor, por favor no reproducir)

Caja de Petri: Tiene forma de disco plano, hecha de plástico y vidrio, es un recipiente de cultivo celular regular, la especificación se distingue por el diámetro del disco, hay especificaciones de 35 mm, 60 mm, 100 mm, 150 mm y otras.

▲Caja de Petri (imagen con derechos de autor, por favor no reproducir)

Matraces de cultivo: en forma de botella, el material es generalmente plástico, pero también recipientes convencionales de cultivo celular, las especificaciones se diferencian por el área del fondo (mm2), hay T25, T75, T150, T175, etc.

▲Caja de Petri (imagen con derechos de autor, por favor no reproducir)

Placa de cultivo: en forma de placa, con pequeños orificios distribuidos en ella, generalmente se utiliza para experimentos, según el número de orificios se divide en placa de 6 pocillos, placa de 12 pocillos, placa de 24 pocillos, placa de 48 pocillos, placa de 96 pocillos, etc.

02  Recuperación celular

Las células se almacenan a una temperatura muy baja durante un período de tiempo prolongado, generalmente en un refrigerador de ultra baja temperatura o en una caja de nitrógeno líquido. Cuando se requieren experimentos celulares, el proceso de descongelación de las células se conoce como recuperación celular.

El principio básico de la reanimación celular es la descongelación rápida, que puede asegurar que los cristales extracelulares se fundan en un período de tiempo muy corto, evitando daños a las células debido a la descongelación lenta que provoca que el agua penetre en las células para formar recristalización intracelular.

Método de operación:

①Precalentar el baño de agua a 37℃;

②Colocar el tubo de criopreservación celular en el baño de agua y agitar vigorosamente hasta que se derrita;

③Transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga, agregar medio completo y centrifugar;

③Transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga, agregar medio completo y centrifugar; ④Descartar el sobrenadante, resuspender las células con medio completo fresco e inocular en el recipiente de cultivo.

Nota: Al resucitar, la acción debe ser rápida para minimizar la formación de cristales de hielo, para no reducir la viabilidad celular después de la reanimación. Si se necesitan más células para resucitar a la vez, la descongelación se puede realizar en lotes, y el tiempo de reanimación se prefiere a 1 minuto para que la descongelación se complete, y no debe ser superior a 2 minutos.

03  Digestión y transfección celular

Cuando las células adherentes crecen hasta el límite del recipiente de cultivo, no podrán continuar creciendo y la actividad celular se inhibirá, por lo que es necesario realizar una operación de digestión y subcultivo antes de que crezcan completamente, generalmente utilizando digestión con tripsina; la tripsina puede hidrolizarse y digerir la proteína de unión celular adherente, de modo que las células se desprenden de la pared. Las células en suspensión, al no estar adheridas a la pared, pueden dividirse directamente en matraces y subcultivarse.

Método de operación:

① Lavar las células 2 veces con PBS;

② Añadir tripsina e incubar a 37℃ durante un tiempo determinado;

③ Después de que las células se encojan hasta adquirir una forma redonda o se desprendan en trozos, añadir medio completo para detener la digestión, desalojar las células y transferirlas al tubo de centrífuga;

Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante, resuspender las células con medio completo fresco e inocular las células en los recipientes de cultivo.

Nota: El tiempo de digestión celular debe ajustarse según las características de las diferentes células; el tiempo de digestión no debe ser demasiado largo, ya que una digestión demasiado prolongada causará un mayor daño a las células, reducirá la tasa de supervivencia, afectará la morfología celular y, al mismo tiempo, no debe forzarse el desprendimiento de las células en caso de digestión insuficiente, lo que también causará daño a las células.

04  Congelación celular

Cuando las células no se utilizan durante un corto período de tiempo, pueden congelarse a bajas temperaturas, lo que reducirá el nivel metabólico de las células a niveles extremadamente bajos sin necesidad de añadir nutrientes. Sin embargo, la congelación celular no es simplemente una congelación directa de las células, ya que el agua del interior de las células formará cristales que perforarán las células y, por lo tanto, causarán la muerte; se requiere la adición del agente protector DMSO para permitir que los niveles del interior de las células permeen prematuramente el exterior de las células.

Método de operación:

① Preparar la solución de congelación celular, la proporción es medio:suero:DMSO=7:2:1, las células preciosas pueden prepararse según la proporción suero:DMSO=9:1;

② Seleccionar células en fase de crecimiento logarítmico, digerir y centrifugar;

③ Desechar el sobrenadante, resuspender utilizando solución de criopreservación celular y dispensar en tubos de criopreservación celular con una densidad celular de 1×106 células/mL a 1×107 células/mL;

④ Utilizar un instrumento de refrigeración programada o una caja de refrigeración programada para reducir lentamente las células a una temperatura baja y colocarlas en un refrigerador de -80℃ o en una caja de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

05  Estudios de casos

Huaren Medical proporciona un servicio profesional de cultivo celular; el equipo de investigación ha realizado el cultivo de cientos de líneas celulares y células primarias, puede ajustarse según las características de las células para obtener el mejor método de cultivo y, al mismo tiempo, podemos proporcionar un servicio personalizado para líneas celulares especiales, incluyendo líneas celulares knockout CRISPR, líneas celulares resistentes a fármacos, líneas celulares de sobreexpresión estable, etc.

▲citograma

· fin ·